比对软件很多，首先大家去收集一下，因为我们是带大家入门，请统一用hisat2(官网HISAT2 website was moved to），并且搞懂它的用法。直接去hisat2的主页下载index文件即可，然后把fastq格式的reads比对上去得到sam文件。 接着用samtools把它转为bam文件，并且排序(注意N和P两种排序区别)索引好，载入IGV，再截图几个基因看看！* 顺便对bam文件进行简单QC，参考直播我的基因组系列。
来源于生信技能树：http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost
在比对之前，我们得了解比对的目的是什么？RNA-Seq数据比对和DNA-Seq数据比对有什么差异？
RNA-Seq数据分析分为很多种，比如说找差异表达基因或寻找新的可变剪切。如果找差异表达基因单纯只需要确定不同的read计数就行的话，我们可以用bowtie, bwa这类比对工具，或者是salmon这类align-free工具，并且后者的速度更快。
但是如果你需要找到新的isoform，或者RNA的可变剪切，看看外显子使用差异的话，你就需要TopHat, HISAT2或者是STAR这类工具用于找到剪切位点。因为RNA-Seq不同于DNA-Seq，DNA在转录成mRNA的时候会把内含子部分去掉。所以mRNA反转的cDNA如果比对不到参考序列，会被分开，重新比对一次，判断中间是否有内含子。
链接：转录组入门（5）： 序列比对 - 简书
最近的Nature Communication发表了一篇题为的Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis的文章--被称之为史上最全RNA-Seq数据分析流程，也是我一直以来想做的事情，只不过他们做的超乎我的想象。文章中在基于参考基因组的转录本分析中所用的工具，是TopHat,HISAT2和STAR,结论就是HISAT2找到junction正确率最高，但是在总数上却比TopHat和STAR少。从这里可以看出HISAT2的二类错误(纳伪）比较少，但是一类错误（弃真）就高起来。
就唯一比对而言，STAR是三者最佳的，主要是因为它不会像TopHat和HISAT2一样在PE比对不上的情况还强行把SE也比对到基因组上。而且在处理较长的read和较短read的不同情况，STAR的稳定性也是最佳的。
就速度而言，HISAT2比STAR和TopHat2平均快上2.5~100倍。
链接：转录组入门（5）： 序列比对 - 简书
为什么比对的时候需要用到index？这里强烈建议大家去看Jimmy写的bowtie算法原理探究bowtie算法原理探究。
高通量测序遇到的第一个问题就是，成千上万甚至上几亿条read如果在合理的时间内比对到参考基因组上，并且保证错误率在接受范围内。为了提高比对速度，就需要根据参考基因组序列，经过BWT算法转换成index，而我们比对的序列其实是index的一个子集。当然转录组比对还要考虑到可变剪切的情况，所以更加复杂。
因此我门不是直接把read回贴到基因组上，而是把read和index进行比较。人类的index一般都是有现成的，我建议大家下载现成的，我曾经尝试过用服务器自己创建index，花的时间让我怀疑人生。
链接：转录组入门（5）： 序列比对 - 简书
来自官网：为了用整个index代表整个基因组，HISAT2 用小的index覆盖了整个基因组&#x