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SCS【3】单细胞转录组数据 GEO 下载及读取
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今天来介绍一下GEO单细胞转录组下载数据以及整理，单细胞测序的原理以及数据结果都与bulk测序的方式有一定的差距，所以我们单独说一下。
桓峰基因的教程不但教您怎么使用，还会定期分析一些相关的文章，学会教程只是基础，但是如果把分析结果整合到文章里面才是目的，觉得我们这些教程还不错，并且您按照我们的教程分析出来不错的结果发了文章记得告知我们，并在文章中感谢一下我们哦！
公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.- 1
桓峰基因公众号推出单细胞系列教程，有需要生信的老师可以联系我们！首选看下转录分析教程整理如下：
前言
单细胞近几年也是越来越火热，因此数据也都上传到GEO，这样我们有些分析就可以不用测序，而是通过单细胞现有的数据进行分析了，目前GEO提供数据大致包括三类：
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原始数据：fastq格式原始测序数据
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经过cellranger标准化后的10X数据
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Counts数据信息
当然我们都希望获得第二种数据，毕竟从原始下机数据fastq处理起来，自己的小电脑也受不起，并且不是每个人都很擅长 Linux 和 shell ，所以有了第二种，对于我们来说算是省去了很多繁琐的步骤。
数据下载
确定我们需要下载的GEO编号，我们这里使用 GSE135927， 登录网站
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
数据集介绍
我们这里选择Cell Ranger生成的raw count。
下载GSE135927_RAW.tar后解压，我们可以看到每个样本有三个文件，包括：
- barcodes.tsv
Barcodes通俗来讲就是每个细胞的代码，组成就是ATCG四个碱基排列组合成的不同的14个碱基组合；
AAACCTGAGGGCTCTC-1 AAACCTGAGTGAACGC-1 AAACCTGGTATGAATG-1 AAACCTGTCTGCGACG-1 AAACGGGAGGTGCAAC-1- 1
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- features.tsv
features.tsv一般是基因的ensembl ID 和symbol
ENSG00000243485 MIR1302-2HG Gene Expression ENSG00000237613 FAM138A Gene Expression ENSG00000186092 OR4F5 Gene Expression ENSG00000238009 AL627309.1 Gene Expression ENSG00000239945 AL627309.3 Gene Expression ENSG00000239906 AL627309.2 Gene Expression ENSG00000241599 AL627309.4 Gene Expression- 1
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- matrix.mtx
matrix.mtx就是每个细胞不同基因的表达矩阵：
%%MatrixMarket matrix coordinate integer general %metadata_json: {"format_version": 2, "software_version": "3.0.1"} 3353813593017342 33509124 3350812 3350716 3350616 33505126 33504119 33503119 33502124 33501113- 1
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软件安装
我们使用Seurat软件包里的函数Read10X()进行数据读取。
if(!require(Seurat)) BiocManager::install("Seurat")- 1
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数据读取
我们发现下载后的每个样本包含三个文件，准备好每个样本一个文件夹。我们先看下函数说明给出来的例子：
1. CellRanger < 3.0
如果是CellRanger < 3.0 单样本读取的时候必须是每个文件格式为 barcodes.tsv, genes.tsv, and matrix.mtx
## Not run: # For output from CellRanger < 3.0 data_dir <- 'path/to/data/directory' list.files(data_dir) # Should show barcodes.tsv, genes.tsv, and matrix.mtx expression_matrix <- Read10X(data.dir = data_dir) seurat_object = CreateSeuratObject(counts = expression_matrix)- 1
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2. CellRanger >= 3.0
如果是CellRanger >= 3.0 单样本读取的时候必须是每个文件格式为barcodes.tsv.gz, features.tsv.gz, and matrix.mtx.gz
# For output from CellRanger >= 3.0 with multiple data types data_dir <- 'path/to/data/directory' list.files(data_dir) # Should show barcodes.tsv.gz, features.tsv.gz, and matrix.mtx.gz data <- Read10X(data.dir = data_dir) seurat_object = CreateSeuratObject(counts = data$`Gene Expression`) seurat_object[['Protein']] = CreateAssayObject(counts = data$`Antibody Capture`)- 1
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3. 实际例子
我们先看下单个样本处理方法和多个样本合并。
单个样本读取
library(Seurat) data_dir <- "./GSE135927" dirs = list.dirs(data_dir) dirs_sample = dirs[2:3] dirs_sample ## [1] "./GSE135927/GSM4038043" "./GSE135927/GSM4038044" GSM4038043 = Read10X(data.dir = dirs_sample[1]) GSM4038043[1:10, 1:3] ## 10 x 3 sparse Matrix of class "dgCMatrix" ## AAACCTGAGGGCTCTC-1 AAACCTGAGTGAACGC-1 AAACCTGGTATGAATG-1 ## MIR1302-2HG . . . ## FAM138A . . . ## OR4F5 . . . ## AL627309.1 . . . ## AL627309.3 . . . ## AL627309.2 . . . ## AL627309.4 . . . ## AL732372.1 . . . ## OR4F29 . . . ## AC114498.1 . . . s1 = CreateSeuratObject(counts = GSM4038043, min.cells = 3, min.features = 200) head(s1@meta.data) ## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA ## AAACCTGAGGGCTCTC-1 SeuratProject 8506 2450 ## AAACCTGAGTGAACGC-1 SeuratProject 5634 1743 ## AAACCTGGTATGAATG-1 SeuratProject 8841 2309 ## AAACCTGTCTGCGACG-1 SeuratProject 4484 1779 ## AAACGGGAGGTGCAAC-1 SeuratProject 8221 2332 ## AAACGGGTCGCTAGCG-1 SeuratProject 6471 2153- 1
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多个样本读取
GSM4038044 = Read10X(data.dir = dirs_sample[2]) s2 = CreateSeuratObject(counts = GSM4038044, min.cells = 3, min.features = 200) m = merge(x = s1, y = s2, add.cell.ids = c("GSM4038043", "GSM4038044"), merge.data = TRUE) as.data.frame(m@assays$RNA@counts[1:10, 1:2]) ## GSM4038043_AAACCTGAGGGCTCTC-1 GSM4038043_AAACCTGAGTGAACGC-1 ## AL669831.5 0 0 ## LINC00115 0 0 ## FAM41C 0 0 ## NOC2L 0 0 ## KLHL17 0 0 ## PLEKHN1 0 0 ## HES4 0 0 ## ISG15 2 0 ## AL645608.2 0 0 ## AGRN 0 0 head(m@meta.data) ## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA ## GSM4038043_AAACCTGAGGGCTCTC-1 SeuratProject 8506 2450 ## GSM4038043_AAACCTGAGTGAACGC-1 SeuratProject 5634 1743 ## GSM4038043_AAACCTGGTATGAATG-1 SeuratProject 8841 2309 ## GSM4038043_AAACCTGTCTGCGACG-1 SeuratProject 4484 1779 ## GSM4038043_AAACGGGAGGTGCAAC-1 SeuratProject 8221 2332 ## GSM4038043_AAACGGGTCGCTAGCG-1 SeuratProject 6471 2153- 1
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总结
另外还有一种，只有一个表格，下载之后可以自己整理结果，例如 GSE135928 下载之后我们看下文件格式：
barcode is_cell contig_id high_confidence length chain v_gene d_gene j_gene c_gene full_length productive cdr3 cdr3_nt reads umis raw_clonotype_id raw_consensus_id AAACGGGTCGTCGTTC-1TRUE AAACGGGTCGTCGTTC-1_contig_1 TRUE582 TRA TRAV5 None TRAJ8 TRAC TRUETRUE CAESSGTGFQKLVF TGTGCAGAGAGTTCCGGCACAGGCTTTCAGAAACTTGTATTT 19453 clonotype17 clonotype17_consensus_2 AAACGGGTCGTCGTTC-1TRUE AAACGGGTCGTCGTTC-1_contig_2 TRUE710 TRB TRBV4-3 TRBD2 TRBJ2-7 TRBC2 TRUETRUE CASSQDSGPSYEQYF TGCGCCAGCAGCCAAGATAGTGGGCCATCCTACGAGCAGTACTTC 468810 clonotype17 clonotype17_consensus_1 AAACGGGTCTCGAGTA-1TRUE AAACGGGTCTCGAGTA-1_contig_1 TRUE689 TRB TRBV5-1 TRBD1 TRBJ2-2 TRBC2 TRUETRUE CASSYRGVNTGELFF TGCGCCAGCAGCTACAGGGGCGTGAACACCGGGGAGCTGTTTTTT 619013 clonotype18 clonotype18_consensus_2 AAACGGGTCTCGAGTA-1TRUE AAACGGGTCTCGAGTA-1_contig_3 TRUE343 Multi None None TRBJ2-3 TRBC2 FALSE None None None 7374 clonotype18 None AAACGGGTCTCGAGTA-1TRUE AAACGGGTCTCGAGTA-1_contig_4 TRUE694 TRA TRAV8-6 None TRAJ52 TRAC TRUETRUE CAVIKANAGGTSYGKLTF TGTGCTGTGATCAAAGCTAATGCTGGTGGTACTAGCTATGGAAAGCTGACATTT 54838 clonotype18 clonotype18_consensus_1 AAAGATGAGGTAAACT-1TRUE AAAGATGAGGTAAACT-1_contig_1 TRUE605 TRA TRAV12-3 None TRAJ22 TRAC TRUETRUE CARGSARQLTF TGTGCACGGGGTTCTGCAAGGCAACTGACCTTT 77239 clonotype19 clonotype19_consensus_1 AAAGATGAGGTAAACT-1TRUE AAAGATGAGGTAAACT-1_contig_3 TRUE543 TRB TRBV6-3 TRBD1 TRBJ2-5 TRBC2 TRUETRUE CASSYSFSGQGGETQYF TGTGCCAGCAGTTACTCATTTTCGGGACAAGGCGGAGAGACCCAGTACTTC 1098420 clonotype19 clonotype19_consensus_2 AAAGATGCACGACGAA-1TRUE AAAGATGCACGACGAA-1_contig_1 TRUE517 TRB TRBV4-1 TRBD2 TRBJ1-1 TRBC1 TRUETRUE CASSQDGLMNTEAFF TGCGCCAGCAGCCAAGATGGACTTATGAACACTGAAGCTTTCTTT 34097 clonotype20 clonotype20_consensus_2 AAAGATGCACGACGAA-1TRUE AAAGATGCACGACGAA-1_contig_2 TRUE543 TRA TRAV23DV6 None TRAJ37 TRAC TRUETRUE CAASRVNTGKLIF TGTGCAGCAAGCAGAGTCAACACAGGCAAACTAATCTTT 20283 clonotype20 clonotype20_consensus_1- 1
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这种格式起始也非常好用，利用TPM计算原理，有length，reads，barcode，raw_consensus_id 等信息计算出来获得一个表达矩阵即可。
桓峰基因，铸造成功的您！
未来桓峰基因公众号将不间断的推出单细胞系列生信分析教程，
敬请期待！！
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References:
- Singh J, Chen ELY, Xing Y, Stefanski HE et al. Generation and function of progenitor T cells from StemRegenin-1-expanded CD34+ human hematopoietic progenitor cells. Blood Adv 2019 Oct 22;3(20):2934-2948. PMID: 31648315
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