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1. 细胞迁移

• 细胞迁移 （cell migration）：是多细胞生物发育和存活关键的生物学过程，是细胞运动的表型之一。胚胎发育时器官的形成、伤口的愈合、免疫应答等都需要细胞非常精准的迁移到特定部位。当有外部信号（化学、机械信号）刺激时，也会引起细胞发生迁移。

• 细胞迁移的机制：
  ① 有的细胞有鞭毛或纤毛，通过鞭毛或纤毛摆动就能运动，如精子；
  ② 通过细胞的变形，带动细胞的移动，如肌动蛋白 Actin 的聚合状态发生改变带动细胞变形。
  △Actin 是细胞骨架的组分之一，Actin 的聚合能使细胞形成突出的角，Actin 在这个角不断加聚，就能不断伸出，随后细胞边缘也发生相应变化，从而带着细胞移动。用带荧光标记的鬼笔环肽染 Actin，看 Actin 的排列是否改变，没有运动起来的细胞，Actin 排列是规整的，运动的细胞 Actin 排列就会变得紊乱，能看到延伸出来的角，细胞极性也发生改变。此外，还可以检测促进 Actin 聚合的分子的表达，如 Arp2/3 复合物、mDia1、mDia2。
  ③ 细胞膜流动：细胞运动时，细胞膜是循环流动的，外面的细胞膜与细胞内的细胞膜库发生交换，导致细胞迁移。
  ④ 细胞移动时还会涉及细胞核的重定位、高尔基体的重定向、微管组织中心的重定向。

• 细胞迁移能力：
  

• 细胞和细胞之间有细胞连接，细胞要能运动，就要先从原位置脱落下来，细胞粘附能力发生改变（粘附实验，检测细胞与细胞连接、细胞与基质连接的相关蛋白的表达，如整合素蛋白；效应器蛋白的表达，如 Rho GTP 酶；细胞粘附相关的信号通路分子如 FAK、Src、Paxillin、Crk、PAK、GIT；能破坏粘附复合物的蛋白酶的表达）；

• 体外培养细胞是让细胞在一个支持物上，细胞在培养皿表面长成单层细胞（2D），检测单层细胞的运动可以用 划痕实验 检测细胞是否具有运动能力。

• 体内细胞是处于 3D 环境，细胞可以从一个平面爬到另一个平面，用 transwell实验。体内细胞还被细胞外基质包裹，细胞要运动就要能穿过细胞基质，用 matrigel 的 transwell 实验来观察细胞的运动能力（侵袭能力）。

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2. 检测细胞迁移：细胞划痕实验

划痕实验检测细胞迁移的原理

• 细胞划痕实验（Scratch assay or wound-healing assay）：
  先让细胞长满单层，细胞之间没有空隙，没有足够的空间可以移动；然后刮除一些细胞（造成“伤痕”），留出一些空间，如果细胞能迅速往这些空着的地方爬，说明细胞有迁移能力。
• 为了保证细胞是自己爬过去而不是因为细胞增殖被挤过去的，就需要用丝裂霉素处理，让细胞停止增殖；或者划出划痕后，把培养基换成无血清的培养基（有的细胞对无血清不耐受，可以少加点血清，维持细胞的状态） ，细胞在无血清的环境中生长极其缓慢，可以认为细胞不增殖。
• 细胞划痕实验是检测细胞在 2D 空间的迁移。
  

划痕实验检测细胞迁移的操作流程

• 适用于检测培养的细胞（贴壁细胞），不适用于检测组织样本

1. 标记 6 孔板：使用 marker 笔在 6 孔板的外底面画平行线。平行线间距约 0.5cm，线画直一点，为了保证后续拍照位置是相同的。
2. 制备细胞悬液：胰酶消化细胞，制备细胞悬液。
3. 铺 6 孔板：细胞计数后铺板，保证每组细胞铺板密度一致，且密度控制在第二天长满单层（提前摸索）。若过夜后细胞未完全长满，也可以适当延长培养时间，但如果细胞密度已经很大，尽量重新铺板，因为可能过一天后细胞太满，会导致细胞状态逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。
4. 制造划痕 ：用直尺比着，使用 10ul 枪制造细胞划痕（枪尖的平面垂直紧贴着培养板平面划过细胞层，最好保持力度一致，尽量一次性划完，保证每个划痕的宽度一样） ，划痕方向与标记线垂直。
   
5. 划痕后用显微镜照相，作为 0h 对照。保存图片为 TIF 格式。
6. 洗：吸去培养基，PBS 轻柔洗 3 次，充分洗去漂浮细胞。PBS 清洗时动作轻柔，贴壁缓慢加入，不要把贴壁细胞洗掉。
7. 换液：换无血清培养基，或低血清培养基（FBS≤2%），将细胞放入 37°C、5% CO₂ 培养箱培养。
8. 定时拍照或实时监测：选择合适时间点拍照，如 0h，6h，12h，24h 后取出细胞于显微镜下拍照。一般认为 24h 为细胞的一个周期，所以检测时间最好不要超过一个周期的时间。每次拍照前都用 PBS 洗 3 次，充分洗去漂浮细胞。
   ◆ 以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照（每 4 小时观察划痕愈合情况，选择处理/对照组迁移能力差异明显的时间点拍照。拍摄与 0h 拍照时的相同位置，放大倍数（100×）相同），或者使用实时检测设备进行实时检测。
   ◆ 划痕与孔板背后 5 条标记线之间有 5 个交点，每个交点的线上和线下各一个定点观测的区域，即每个孔共有 10 个定点观测区域，每次拍照就拍这 10 个区域，拍照时标记线不要出现在视野内，而是刚好沿着标记线的边拍照。
   ◆ 细胞生长具有边缘效应，所以边缘细胞生长状态可能与中间的细胞不太一样，不宜作为观测点，去掉 1 和 10，最后可能只剩下中间 8 个甚至 6 个观测点。
   

细胞划痕实验分组设计

数据处理与绘图

• 使用软件分析每个时间点划痕的宽度或划痕的面积（可以使用 image pro plus 或 imageJ）。
  ◆ image pro plus 分析划痕：划痕的边经常不规则，所以测距离不准确，但可以通过划痕的面积（拍照时，划痕贯穿整个图片，所以划痕的高度是固定的），得到划痕之间的平均距离。
  △ 计算划痕处的面积及高度，划痕宽度 = $\frac{划痕面积Area}{划痕高度BoxHeight}$
  △ 细胞迁移率计算公式：
  细胞迁移率 $=$ $\frac{（初始宽度-终点宽度）}{初始宽度}$
  ◆ imageJ 分析划痕：
  伤口愈合百分比 $=$$\frac{（初始划痕面积-某一时间点的划痕面积）}{初始划痕面积}$
  参考：
  ImageJ：细胞划痕实验分析
  万能的 image j 分析划痕图片（录制宏）

• 计算公式：
  migration index=migration distance of test group/migratance distance of control group
  细胞迁移指数 = $\frac{实验组迁移距离}{对照组迁移距离}$

• 将 3 次独立重复的数据取平均值，数值大者说明细胞迁移快，t-test 统计 p 值并绘制柱状图。
  

  • U 未诱导处理的细胞
  • I 经诱导处理的细胞

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3. 检测细胞迁移：transwell 实验

transwell 实验（transwell assay）检测细胞迁移的原理

• 需要特定孔径的 transwell 板（transwell 小室）。
• 上室可以架在细胞培养板的孔上，底部是一层带很多小孔的薄膜（肉眼看不到孔，孔径大小根据培养的细胞大小来选择，一般下室 24 孔板的用孔径 8μm 的，肿瘤细胞侵袭实验常用 8µm、12µm 膜），不接触细胞培养板。
• 下室需要高血清，上室需要低血清，以诱导细胞迁移。
• 在上室低血清培养基中种过量的细胞，如果细胞没有迁移能力，8μm 的孔径小于细胞，上室中的细胞和培养液不能通过小孔进入下室；有迁移能力的细胞能变形，下室铺的培养基多加血清，促使细胞迁移到下室，细胞就会穿过小孔粘附在上室底膜的下表面（对于粘附能力弱的细胞，容易掉进下室，就需要在种细胞前预先对上室膜的下表面涂一些增加细胞粘附的东西，如 10ug/ml 的纤连蛋白）。
• 结束实验检测结果时，transwell 小室的上室膜上表面里会有大量没有穿过孔的细胞累积，上室膜的下表面粘附着穿过小孔的细胞，用棉签擦掉上室膜上表面的细胞，将上室放入染色液染色，使下表面的细胞着色，就可以在显微镜下拍照。
• 模拟细胞在 3D 空间的迁移。
• transwell 板：Corning 3422 性价比较高。

transwell 实验检测细胞迁移的操作流程

• 适用于检测贴壁的细胞，不适用于检测组织样本 。

1. 撤血清：换无血清或低血清（5% FBS，无血清不耐受时）培养基培养细胞，清除血清的影响。
2. 铺下室培养基：下室铺含 20% FBS 的培养基（有些特殊实验可以加趋化因子）。
3. 制备细胞悬液：胰酶消化细胞，制备细胞悬液。
4. 铺细胞：将上层小室放入下层小室，细胞计数后将细胞铺在上层小室中（一般铺 100ul 细胞，细胞要多一点）。
5. 继续培养：细胞培养箱中培养 24-48 小时，具体时间视不同细胞而定（不同细胞迁移能力不同，提前摸索时间，看细胞什么时候能穿过小孔。接种的细胞量和实验时间非常重要，如果细胞数太多或是培养时间太长，都会使本来有迁移及侵袭能力差别的细胞之间的差别不显著甚至是没有。这个首先可以参考文献的细胞用量及时间，再结合自己的要求进行实验，所以刚开始时不要做太多的处理组，而要把条件摸好再说）。
6. 擦去上层细胞：用棉签（棉签头扯松一点，可以擦到边角）擦去上层小室里的细胞。
7. 固定细胞：甲醇室温固定细胞 5min 或用 4%多聚甲醛室温固定 20min（防止细胞形态发生改变） 。
8. 吉姆萨染色：吉姆萨染色液染细胞，去离子水适度漂洗，去除浮色。（吉姆萨染色液染的色很容易被水洗掉，染色后稍微漂洗 1-2s 就立刻观察细胞颜色）
9. 拍照：把染色漂洗后的上室放在一片干净的载玻片上，带膜的底面贴着载玻片，拍照时不要让细胞完全干燥，可以微微湿润，借助水的折射可以让细胞拍出来更好看。拍照时，建议把上室底面按十字划分，沿十字线拍一遍，再把四角各拍一张，相当于把整个底面扫了一遍。
   

transwell 实验检测细胞迁移实验分组设计

数据处理与绘图

• 使用软件分析迁移的细胞数（可以使用 image pro plus 或 imageJ）。
  参考：应用Image J进行Transwell迁移细胞计数
• 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。
• 显微镜下拍到的图片，浅灰色底，紫红色细胞，任意拍几个视野，对图上细胞计数，按平均每个视野的细胞数做统计分析画图。
  

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