艾美捷双链RNA定量试剂盒试验方案

艾美捷双链RNA定量试剂盒基本参数：

品名：双链RNA（dsRNA），ELISA试剂盒

同义词名称：dsRNA ELISA试剂盒

仅供研究使用。不适用于诊断程序。

克隆性：单克隆

同位素：小鼠IgG2a-kappa/IgM-kappa

克隆编号：J2/K2

物种反应性：全体的

艾美捷双链RNA定量试剂盒来源：

本试剂盒中使用的两种dsRNA抗体如下：雌性DBA/2小鼠腹腔注射50ug L-dsRNA和75ug甲基化牛血清白蛋白的混合物，在完全弗氏佐剂中乳化。在几次增强后，将脾细胞与Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤克隆J2和K2。

该试剂盒包含以下试剂，用于200次测试（2x96孔）：

试剂01：1小瓶包衣抗体（储存于-20℃

试剂A：1小瓶142 bp dsRNA作为阳性对照（储存于-20℃）

试剂B：1小瓶dsRNA特异性检测抗体（在RPMI+5%FBS中，储存在+4℃或最好是-20℃）

试剂C：1小瓶HRP缀合的F（ab’）2山羊抗小鼠二级抗体片段（储存于+4℃或-20℃）

试剂D：1小瓶TMB底物溶液（储存于+4℃，避光

艾美捷双链RNA定量试剂盒试验方案：

所需但未提供的材料和设备

2个ELISA板（96孔）

具有370 nm和450 nm双波长能力的微量板读数分光光度计。

单通道移液管-10ul和200ul

多通道移液管-200ul

抗原（标准和样品）稀释剂（STE缓冲液：0.1M NaCl、1mM EDTA、50mM Tris-HCl，pH7.0）

洗涤缓冲液（PBS+0.5%吐温20；PBS:10mM Pi缓冲液，pH7.2，0.15M NaCl）

二级抗体稀释缓冲液（PBS+1%BSA）

培养箱，允许在37℃下培养。

2米硫酸氢

试剂和ELISA板的制备

通过加入4ul不含RNase的MilliQ水，重新配制试剂A。浓度为1ug/ul dsRNA。（储存于-20摄氏度或-80摄氏度）

使用DEPC处理过的MilliQ水制备STE（适用于您自己的样品制备）

通过高压灭菌灭菌PBS和STE

制备PBS+1%BSA和ELISA洗涤缓冲液

ELISA板涂层

将试剂01管的总含量转移到21 ml PBS中，充分混合并立即在2个ELISA板中分配100ul/孔。

盖上盘子，在4摄氏度下孵育过夜。

将井中的内容物丢弃到废物中。向每个孔中加入100ul/孔1%BSA在PBS+0.2%NaN3中的溶液，并在37℃下孵育2小时，以饱和板上任何剩余的自由结合位点。

丢弃溶液并用PBS+0.5%吐温20洗涤板3次。

然后可以直接使用或储存这些板。为了储存，用含0.2%叠氮化钠的200ul/孔PBS填充孔。将盘子用塑料箔包裹起来，在4摄氏度下冷藏保存。它们可以在一个月内保持活力。使用储存板时，必须用PBS彻底清洗，以去除所有痕量的NaN3。

1个板的分析方案：

所有标准品和样品应至少检测两份。

使用干净、无RNase的带盖微型离心管。

不要使用含有NaN3的缓冲液，因为它会干扰最终检测步骤。

1.从试剂A制备1:3系列稀释液。dsRNA标准品的稀释系列应在样品的预期dsRNA浓度范围内。我们建议以30ng dsRNA/孔作为最高浓度，并稀释至低于0.01ng dsRNA/孔。每次化验应新鲜稀释。

2.在STE中制备样品稀释液（必要时）。

3.盖上并旋涡所有稀释的标准品和样品。

4.从ELISA板上取下塑料箔，丢弃液体并用PBS+0.5%吐温20洗涤两次。

5.丢弃溶液并将100-100ul抗原转移到板中的重复孔中。

6.盖上盖子并在37℃下孵育60分钟。

7.将井中的内容物丢弃到废物中。用PBS+0.5%吐温20洗涤板4次，每孔加入250ul洗涤液。在加入下一种溶液之前，不要让井变干。

8.用移液管将100ul未稀释试剂B移到所有孔中。

9.盖上盖子，在37℃下孵育60分钟。

10.在孵育（步骤9）期间，通过将1.4ul试剂C移液至10ml PBS+1%BSA

艾美捷双链RNA定量试剂盒原理：

基于使用两种双链 RNA (dsRNA) 特异性单克隆抗体，dsRNA 检测试剂盒可以灵敏和选择性地检测 dsRNA 分子（大于 30-40 bp），而不受其核苷酸组成和序列的影响。检测具有高度特异性：在存在 1.000-10.000 倍过量其他核酸的情况下，可以检测核酸提取物中的dsRNA。该测定基于双抗夹心ELISA原理，使用 J2 (IgG2a) 小鼠单克隆抗体作为捕获抗体，单克隆抗体 K2 (IgM) 用作检测抗体。