Naopore基因组数据组装软件---NECAT下载试用

1. NECAT软件简介和下载

NECAT（https://github.com/xiaochuanle/NECAT）是一种用于 Nanopore 长噪声reads的纠错和从头组装工具。该软件结果发表在Nature Communications上，可以去看原文学习：

Chen Y, Nie F, Xie S Q, et al. Efficient assembly of nanopore reads via highly accurate and intact error correction[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 1-10.
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目前最新版本是2020-8-03日更新的。
下载直接使用conda了，方便：

conda activate necat
conda install -c bioconda necat
## 输出软件信息有点点问题，不影响使用
necat 
Smartmatch is experimental at /home/debian/bin/miniconda3/envs/necat/share/necat-0.0.1_update20200803-1/bin/Plgd/Project.pm line 263.
Usage: necat.pl correct|assemble|bridge|config cfg_fname
    correct:     correct rawreads
    assemble:    generate contigs
    bridge:      bridge contigs
    config:      generate default config file ## 生成config file
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2. NECAT使用步骤（以拟南芥Nanopore数据为例）

根据github中quickstart介绍，首先需要将软件放入Linux环境变量中确保正常运行，之后开始：

（1）necat生成config文件

生成命令：

necat config  config.txt
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config.txt 文件内容：

PROJECT=
ONT_READ_LIST=
GENOME_SIZE=
THREADS=4
MIN_READ_LENGTH=3000
PREP_OUTPUT_COVERAGE=40
OVLP_FAST_OPTIONS=-n 500 -z 20 -b 2000 -e 0.5 -j 0 -u 1 -a 1000
OVLP_SENSITIVE_OPTIONS=-n 500 -z 10 -e 0.5 -j 0 -u 1 -a 1000
CNS_FAST_OPTIONS=-a 2000 -x 4 -y 12 -l 1000 -e 0.5 -p 0.8 -u 0
CNS_SENSITIVE_OPTIONS=-a 2000 -x 4 -y 12 -l 1000 -e 0.5 -p 0.8 -u 0
TRIM_OVLP_OPTIONS=-n 100 -z 10 -b 2000 -e 0.5 -j 1 -u 1 -a 400
ASM_OVLP_OPTIONS=-n 100 -z 10 -b 2000 -e 0.5 -j 1 -u 0 -a 400
NUM_ITER=2
CNS_OUTPUT_COVERAGE=30
CLEANUP=1
USE_GRID=false
GRID_NODE=0
GRID_OPTIONS=
SMALL_MEMORY=0
FSA_OL_FILTER_OPTIONS=
FSA_ASSEMBLE_OPTIONS=
FSA_CTG_BRIDGE_OPTIONS=
POLISH_CONTIGS=true
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根据自己的物种和数据名修改上面的config.txt 文件。
nanopore数据文件read_list.txt，文件中nanopore数据的内容不必相同，可以存在fastq，fasta，或者gzip格式，我们的拟南芥仅为一个文件：

## cat read_list.txt
/home/debian/data/08.arabidopsis_t2t_genome/CRR302667/CRR302667.fastq.gz
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设置必须的参数值：

PROJECT=Arabidopsis ## 输出结果文件的文件名
ONT_READ_LIST=read_list.txt ## nanopore数据路径及文件名
GENOME_SIZE=138000000  ## 基因组大小
THREADS=20 ## 20个线程
MIN_READ_LENGTH=3000  ## 最短length
PREP_OUTPUT_COVERAGE=40  ## 设定corrected reads的覆盖度，这里是40X
OVLP_FAST_OPTIONS=-n 500 -z 20 -b 2000 -e 0.5 -j 0 -u 1 -a 1000
OVLP_SENSITIVE_OPTIONS=-n 500 -z 10 -e 0.5 -j 0 -u 1 -a 1000
CNS_FAST_OPTIONS=-a 2000 -x 4 -y 12 -l 1000 -e 0.5 -p 0.8 -u 0
CNS_SENSITIVE_OPTIONS=-a 2000 -x 4 -y 12 -l 1000 -e 0.5 -p 0.8 -u 0
TRIM_OVLP_OPTIONS=-n 100 -z 10 -b 2000 -e 0.5 -j 1 -u 1 -a 400
ASM_OVLP_OPTIONS=-n 100 -z 10 -b 2000 -e 0.5 -j 1 -u 0 -a 400
NUM_ITER=2
CNS_OUTPUT_COVERAGE=30   ## 最长的30X数据用于后续组装
CLEANUP=1
USE_GRID=false
GRID_NODE=0
GRID_OPTIONS=
SMALL_MEMORY=0
FSA_OL_FILTER_OPTIONS=
FSA_ASSEMBLE_OPTIONS=
FSA_CTG_BRIDGE_OPTIONS=
POLISH_CONTIGS=true  ## 设置最后bridge结果是否polish
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（2）necat矫正nanopore数据

necat矫正

## run necat
time necat  correct config.txt
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Note：

（1）The pipeline only corrects longest 40X (PREP_OUTPUT_COVERAGE) raw reads. 
The corrected reads are in the files ./ecoli/1-consensus/cns_iter${NUM_ITER}/cns.fasta.gz

（2）The longest 30X (CNS_OUTPUT_COVERAGE) corrected reads are extracted for assembly,
 which are in the file ./ecoli/1-consensus/cns_final.fasta.gz
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（3）necat组装nanopore数据

necat组装，使用的数据是Arabidopsis/1-consensus/cns_final.fasta.gz，如果上面的矫正未运行，那么这步也会运行矫正：

time necat  assemble config.txt
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assemble结果为：

Arabidopsis/4-fsa/contigs.fasta
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（4）necat bridge nanopore数据（将结果链接起来）

necat bidge命令：

time necat  bridge  config.txt
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bridge结果：

Arabidopsis/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta
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注意：

If POLISH_CONTIGS is set, the pipeline uses the corrected reads to polish the bridged contigs.
The polished contigs are in the file ./ecoli/6-bridge_contigs/polished_contigs.fasta
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因为我们上面也是设置的POLISH_CONTIGS=true，所以最终birdge的结果还进行了polish。从结果文件大小可以看出两个文件存在细微差别，polish的长约17k：

ll  Arabidopsis/6-bridge_contigs/*_contigs.fasta 
-rw-r--r-- 1 debian debian 128470228 9月   2 02:20 Arabidopsis/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta
-rw-r--r-- 1 debian debian 128487860 9月   2 04:22 Arabidopsis/6-bridge_contigs/polished_contigs.fasta
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此处拟南芥组装得到的基因组大小为~128.48Mb，设置了20个threads，运行速度一天，整体结束（500G RAM and 28cpu debian sever）。命令前面使用time 是为了输出软件运行时间。

参考：
https://github.com/xiaochuanle/NECAT （github地址）
https://www.nature.com/articles/s41467-020-20236-7 （文章）