课程名称： 细胞生物学实验原理考题
选择题 名词解释 问答题 合计
得 分 40 12 48 100分
一、选择题（20 × 2）
1.细胞的无菌培养需要用到净化工作室的洁净级别为（）
A 100 B 1000 C 1万 D 10万
[参考答案]C;
净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。简称：万级细胞间，百级超净台
2.用于培养细胞的液体培养基，它的灭菌条件一般是用____μm滤膜过滤？
A.0.45 μm B.0.5μm C.0.22μm D.0.3μm
[参考答案]C
细菌的大小普遍是大于或者等于0.2um，但是实际上0.2um大小的细菌很少，0.22um孔径的滤膜足以过滤掉绝大部分细菌，甚至是环境中或者水样中的所有细菌。0.22um，除菌过滤，细菌被截留，并且很多细菌由于受到压力而破，死亡。0.45um，降低微生物负荷，细菌大部分被截留，并且很多细菌嵌入滤膜。培养基灭菌采用0.22um滤膜或高压蒸汽灭菌（营养成分会流失）。
3.下列哪一个描述正确的是？
A台盼蓝可以染死细胞
B可以用平衡盐溶液培养细胞
C.所用的培养基，均可以配置好一个月的用量放在2~8℃冰箱中保存
[参考答案] A
死亡细胞胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡；而普通的液体培养基，密封灭菌后放置在2-8℃冰箱内可以保存三个月，普通的培养基平板可以保存一个月或更久。但是如果培养基中含有易分解的物质，那么保留的时间就很短甚至需要现配现用。但一般培养基保存于4℃冰箱中，培养基内CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中酸碱指示剂的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱后再用于细胞培养将造成细胞生长停滞或死亡。培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH值。
4.设定培养细胞的二氧化碳培养箱的条件是____？
A.25℃，5% CO2 B.25℃，10% CO2 C.37℃，10% CO2 D.37℃，5% CO2
[参考答案] D
二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，培养箱要求稳定的温度(37°C)、稳定的CO2水平(5%)、恒定的酸碱度(pH值:7.2-7.4)、较高的相对饱和湿度(95%)，来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。
5.下列哪种溶液不能在含钙镁离子的环境中工作
A胰酶 B胶原酶 C双抗溶液 D谷氨酰氨溶液
[参考答案] A
钙离子和镁离子会影响胰酶的消化能力，导致胰酶消化能力下降，培养细胞时，消化的细胞数量有限，加上细胞的密度依赖性，所以细胞培养时最好使用不含有钙镁离子的PBS缓冲液。
6.实验室用的双抗溶液一般是指____？
A.四环素-链霉素 B.嘌呤霉素-青霉素 C青霉素-链霉素
[参考答案]C
青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin Solution）混合液，通常也被称为“双抗”，是体外培养中为预防微生物污染最常用的抗生素，常配制成100倍浓度母液使用。其中，青霉素能够干扰细菌细胞壁的合成，对革兰阳性菌特别有效；而链霉素能够与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效，但对革兰氏阴性菌特别有效。青霉素和链霉素联合使用可以预防绝大部分的细菌污染，但青霉素溶液对温度和酸碱度较为敏感，室温易降解，需冷冻保存，PH 6.0～6.5时最为稳定；而链霉素则相对稳定，PH 5.0～7.5时最为稳定
7.对于组织取材的原则不包含____？
A严格无菌 B要用锋利的器械切组织，尽量减少组织的损伤
C尽量选取过分化的组织 D注意快速新鲜，尽量在4~6小时之内完成
[参考答案]C
B取材需要用锋利的器械，正确，C.取材选择新鲜和分化程度低的组织
8.对于用CFSE检测细胞的增殖实验，下列哪一个描述是正确的？
A SFEM是一种可穿过细胞膜的荧光染料
B其与细胞内分子的结合是可逆的
C子代细胞中的荧光强度是亲代细胞的一倍
D对于用流式检测SFEM，可以选择653nm的激光做为它的激发光源
[参考答案]A
CFSE荧光染料是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性（不可逆）；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
9.进行细胞冻融时，需遵从____原则？
A.慢冻快融 B.慢冻慢融 C.快动慢融 D.快动快融
[参考答案]A
慢冻，主要是防止细胞在冷冻过程中形成冰晶，对细胞造成损害，加DMSO也是这个原理。 复苏细胞的原则是：快融。 主要是防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用，快速使细胞进入复苏和生长状态。
10.在培养细胞时，发现细胞培养液中有浑浊且pH值下降，请问是什么造成了其污染？
A真菌 B细菌 C原虫 D病毒
[参考答案]B
(1)细菌污染后培养基的pH值会突然降低，短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生；
有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。
(2)真菌污染：真菌污染培养液清亮透明，丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列
(3)支原体感染：细胞培养过程中, 支原体感染发生率高达30%~60%,支原体是广泛存在于自然界中能独立生活的最小微生物，直径300-800 nm。更易透过0.22-0.45 μm滤膜。受支原体污染的细胞在培养时培养基的pH值不会发生改变, 也不会浑浊，因此, 很难直接观察出细胞是否受到污染。
11.对于自噬的检测，下列说法正确的是
A正常培养的细胞有较高的自噬活性，可以进行直接的自噬检测
B可以用激光共聚焦显微镜直接观察自噬小体的形成
C可以构建GFP-LC3质粒转染细胞，当自噬形成时，细胞中的LC3蛋白会向自噬小体迁移，我们可以检测自噬小体中的荧光点数来判断是自噬的程度
D可以用细胞中的LC3 II/I的比值表示自噬的强弱程度，LC3 II/I值越小说明自噬越强
[参考答案]C
A.正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，错误；
B.自噬小体属于亚细胞结构，普通显微镜镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
C.在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以 通过计数来评价自噬活性的高低。
D.自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低，值越大说明自噬越强。
12.对于凋亡的检测，用Annexin V/PI，流式结果显示Annexin V+/PI-，请问这一结果预示着细胞处于凋亡的哪个阶段____？
A.凋亡中期 B.凋亡晚期 C.活细胞 D.凋亡早期
[参考答案]D
解析：AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
13.显微镜的分辨率取决于____？
A物镜 B目镜 C.棱镜
[参考答案]A
显微镜的分辨率是由物镜决定的，分辨率与波长和物镜数值孔径有关系。
14.10x单细胞测序，下列哪一个不是用于控制一个beads和一个细胞结合的
A液流缓慢 B beads数量远大于细胞数
C后期通过QC去除 D让一个beads和一个细胞落在一个96孔板中
[参考答案]D
10x单细胞测序的制样要点：第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。但是还是有个别的droplet里面会两个或者更多的细胞，通过QC进行去除。
15.10x单细胞测序的GEM不包括____？
A逆转录酶 B细胞 C凝胶珠 D转座酶
[参考答案]D
10×制样采用的Gel bead in emulsion(GEM)，凝胶珠、细胞、逆转录酶（反转mRNA）是囊括在内的
16.逆转录病毒的有关叙述错误的是____？
A逆转录病毒可致癌
B逆转录病毒可以转染非分裂的细胞
C逆转录病毒感染效率高，且细胞不容易死亡
D 逆转录病毒的转染效率高，被感染的细胞可以持续多代繁殖
[参考答案]B
逆转录病毒的特点 ：①就目前所知,在大多数情况下,逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene,ONC）都能够在细胞中转录. ②逆转录病毒的寄主范围相当广泛,包括无脊椎动物,其中有的还能够在人体细胞中生长； ③逆转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力，但逆转录病毒的缺点是只能感染能够分裂的细胞，同时整合的时候会导致宿主基因组突变，有潜在的致瘤性。
17.分别取两个品种的小鼠对它进行照射，检测小鼠尿液中的白蛋白含量（+++，++，+），若要比较小鼠的差异情况应选择哪种分析方法？
A. T检验 B f分析 C卡方分析 D非参数检验
[参考答案]A
A.如果是同一组患者治疗前后某项指标的变化是否存在显著差异，通常可以采用配对样本T检验的方式进行考察。配对T检验与独立T检验其中比较容易混淆的是独立样本t检验和配对样本t检验。两者的主要区别在于：配对样本t检验需要两组样本数相等，且要求每对配对数据之间要有一定的对应关系，而独立样本t检验两组数据的样本个数可以不等。
B.F分析：用于两个及两个以上样本均数差别的显著性检验。 由于各种因素的影响，研究所得的数据呈现波动状
C.卡方检验是一种用途很广的计数资料的假设检验方法。它属于非参数检验的范畴，主要是比较两个及两个以上样本率( 构成比）以及两个分类变量的关联性分析。其根本思想就是在于比较理论频数和实际频数的吻合程度或拟合优度问题。
18.对于CRISPER-Cas9技术的优势描述，下列错误的是
A只需要sgRNA，就可以对目的DNA进行特异修饰
B sgRNA比较小，容易合成
C特异性
D sgRNA短，载量低，避免了载量高带的并发症
[参考答案]A
CRISPER-Cas9要对目的DNA进行特异修饰，需要同时提供oligo修复模板
19.研究蛋白互作的技术不包括____？
A.SPR B.qPCR C.Co-IP D. FRET.
[参考答案]B
A.SPR 表面等离子共振（SPR）是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。
C. Co-IP 免疫共沉淀，经典的蛋白互作研究技术
D. 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
20.首先提出假设（由于未经检验是否成立，所以称为无效假设），用适当的统计方法确定假设成立的可能性大小，如果可能性小，则认为假设不成立，拒绝它；如果可能性大，还不能认为它不成立，这是（ A ）的过程；
A.反证法思想 B.小概率思想 C.假设检验 D.大概率思想
[参考答案]A
假设检验的原理：假设检验的基本思想是反证法和小概率思想。
反证法思想：首先提出假设，用适当的统计方法确定假设成立的可能性大小，如果可能性小，则认为假设不成立，拒绝它。
小概率原理：是指小概率事件在一次随机试验中基本不会发生；概率小于多少算小概率是相对的，在进行统计分析时要事先规定，即检验水准。
二、名词解释（3分/题）
1.一代生存期
培养细胞的“一代生存期”，是从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间。细胞传一代后，一般历经3个阶段潜伏期、指数生长期、衰退期。
2.sgRNA
sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用。也称向导RNA（guide RNA，gRNA），作用于动质体（kinetoplastid）体内一种称为RNA编辑（RNA editing）的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶。
3.瞬时转染
瞬时转染（transient transfection）是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞。
4.组织工程
组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增,然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。
三、简答题（48分）
1.简述光学显微镜和电子显微镜的区别
区别：
1．光学显微镜使用可见光作为光源，而电子显微镜利用高能短波长电子束代替可见光。
2．光镜的聚焦镜使用光学学镜片，电镜则使用电磁透镜。
3．成像系统不同。光学显微镜是利用振幅衬度，而电子显微镜是利用相位衬度，借助CCD成像
4．放大倍数不同，光镜一般最大能放大到2000x，电镜则可高达数十万倍。
5．光镜仅能观察到表面微细结构，电镜可获取晶体结构、微细组织、化学组成、电子分布情况等。
或：
电镜 光学显微镜
光源 电子束 可见光
光镜聚焦镜 电磁透镜 光学棱镜
成像系统 荧光屏、底片、CCD 凸透镜放大
成像机制 相位衬度 振幅衬度
分辨率 nm，亚显微结构 um，显微结构
样品要求 真空成像，厚度50 -80 nm左右 切片厚度 3- 5 um
2.流式细胞术四种对照和作用
1.空白对照 (negative control) 自发荧光/本底荧光对照 未染色的细胞 空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。
2.同型对照：使用同种型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合而产生的背景。
3.荧光补偿对照：当多种荧光被单波长激发时，荧光发射光谱会产生重叠，为纠正荧光光谱重叠-细胞样本分别用单独的荧光抗体染色，来决定荧光重叠的水平，确定适合补偿
4.阳性对照：一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。
3.统计学分析方法选择注意因素
1、看资料中的反应变量是单变量、双变量、多变量。
2、看属于这三种资料里的哪一种，计量资料、计数资料、等级资料
拿到数据开始分析之前，一定要进行数据类型的划分
3、看是单因素还是多因素
4、看是单样本、两样本、还是多样本
5、看是否是配对或者配伍设计
6、看是否满足检验方法所需要的前提条件
4.蛋白X与IFN-β抗病毒信号转导通路有重要作用，蛋白X与IFN-β结合后被泛素化，设计实验方案确定蛋白X是否被泛素化 泛素化的位点和介导的E3泛素连接酶类型
（1）目的蛋白是否被泛素化？
①WB检测：目的蛋白降解与蛋白酶体有关
②正反向IP实验：WB检测泛素IP下来的蛋白中是否有目的蛋白
③蛋白酶体抑制剂能够抑制目的蛋白的降解
（2）目的蛋白被哪个E3所催化泛素化，确定泛素化的类型
确认泛素连接酶，并当使用突变的泛素时，不能使目的蛋白泛素化
（3） 确定目的蛋白泛素化的位点
5.蛋白A在跨膜蛋白，有胞外区、胞内区、跨膜区，确定蛋白A在小鼠各脏器表达的转录水平和蛋白水平，并设计实验证明A基因过表达敲除或降低表达水平对细胞增殖活、细胞凋亡的影响（简述实验设计和方案）
实验设计：
1、qPCR引物检测蛋白A在各组织的表达、WB检测各组织的蛋白表达水平
2、采用shRNA敲低或CRISPR-CAS9敲除、过表达载体进行过表达，采用WB进行验证敲除或过表达效率
3、在第2步成功基础上，根据其可能的功能，检测敲除或过表达后细胞增殖和凋亡
（1）细胞增殖 ：
MTT检测法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
CCK 、Ki67检测法进行，优先选择Brdu,可以检测活体
（2）细胞凋亡检测
形态学检测：
光学显微镜和倒置显微镜1、未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
其他检测方法
1.染色细胞 ：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
2.Annexin V /PI:
3. DNA 片段化
4. TUNEL
5. 线粒体膜电位 ：而线粒体跨膜电位的下降 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件
6. 细胞色素c释放
7. Caspase活性
8. 凋亡相关蛋白检测