Jackson关于Western Blot、IHC 和 ELISA 的显色检测分析

前言：

显色底物用于比色检测。它们简单易用。适用于大多数免疫技术——从免疫组织化学到蛋白质印迹和 ELISA，它们提供了一种J具成本效益的检测方法。

这期的主题是Jackson ImmunoResearch公司为大家讲解：Western Blot、IHC 和 ELISA 的显色检测。

显色底物可用于许多免疫组织化学应用，从 IHC 染色组织到蛋白质印迹。将显色底物添加到先前与酶偶联抗体（通常是辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP)）孵育的印迹或组织中，将底物转化为有色沉淀物。通过简单地洗掉基板来阻止信号发展。沉淀物肉眼可见，在蛋白质印迹上，无需特殊设备即可检测为彩色条带。用于免疫组化 (IHC) 时，在正常光学显微镜下可以在组织上看到显色沉淀。

 

 

图 1：间接比色检测。A. 报告酶偶联二抗可检测目的蛋白的一抗。B. 将显色底物添加到抗体-抗原复合物中。C. 报道酶偶联物催化显色底物转化为有色不溶性沉淀物，在印迹膜上肉眼可见。

一、Jackson：溶解度

显色试剂可用于不同的报告酶、HRP、AP、GOD（葡萄糖氧化酶）和 β-Gal（β 半乳糖苷酶）。基材有不同的颜色和灵敏度。根据测定，可以选择可溶性或不溶性底物。

不溶于醇的色原适用于使用复染剂或封固剂的蛋白质印迹和 IHC。可溶性染料更适合 ELISA 和基于板的测定。

二、Jackson公司：Western印迹和斑点印迹

当用于蛋白质印迹或斑点印迹时，显色底物在膜上固定抗原抗体复合物的位置显示为彩色条带或斑点（图 2 和 3）。印迹可以显影，直到条带的信号达到所需的强度，这允许良好的灵敏度水平，因为可以直接观察印迹的发展，并且通过洗去底物立即停止反应。然后可以对显影的膜进行成像或存储以供后续使用。样品浓度低（低抗原）的样品可能需要延长显影时间，这可能导致背景较高、条带模糊。

 

三、Jackson公司：酶联免疫吸附试验

比色 ELISA 测量可溶性有色产品的光密度，该光密度通常与样品中存在的分析物的量成正比，从而可以对分析物进行相对定量。与其他免疫技术一样，ELISA 需要优化时间和开发条件，以获得准确且可重复的测定。（图4）

 

四、Jackson公司：免疫组织化学

比色检测对于组织和细胞的免疫染色来说是一种非常灵敏的方法。不同的底物提供不同的灵敏度和颜色以帮助识别，多种抗原识别是可能的，因为颜色可以与一种底物和另一种底物区分开来。有许多复染剂可用，可用于增加对比度，使 IHC 染色看起来更强。图 5 显示了3,3' 二氨基联苯胺（ DAB 染色）与细胞核的苏木精复染的棕色。

 

五、Jackson公司：报告酶（与抗体偶联）

J常见的偶联报告酶是来自辣根植物Armoracia rusticana的辣根过氧化物酶 (HRP)和来自小牛肠的碱性磷酸酶 (AP)，尽管来自大肠杆菌的葡萄糖氧化酶 (GOD) 和 ß-D-半乳糖苷酶也可以使用。HRP 和 AP 都根据应用要求提供不同的优势。HRP 是一种 40 kDa 的小分子，通常以 4:1 的比例与抗体结合。它的小尺寸意味着良好的细胞内渗透性，并且不太可能引起抗原/抗体复合物的空间位阻。AP 稍大（86 kDa），可能会导致空间干扰，但底物转化反应是线性的，这可能意味着检测孵育时间可以延长，并且可能更敏感。AP 还消除了对具有高水平内源性过氧化物酶（HRP 中的一个限制因素）的组织进行非特异性染色的可能性。