Worthington过氧化物酶活性的6种测定方法

过氧化物酶 (HRP) 是一种血红蛋白，可催化过氧化氢氧化多种底物，例如抗坏血酸盐、亚铁氰化物、细胞色素 c 和许多染料的无色形式。HRP 的分子量为 40 kDa，最适 pH 值为 7.0。稳定性：HPOFF 在 2-8°C 下可稳定 9-12 个月。HPOD 在 2-8°C 下可稳定 2 至 3 年。

单位定义：一个 Worthington 单位在 25°C、pH 7.0 下使用氨基安替比林和苯酚每分钟分解 1µmole H 2 O 2 。

技术说明：RZ (Reinheitzahl) 是吸光度比率，A 403 /A 275，已被用作纯度的指示。然而，Shannon et al., JBC, 241 , 266 (1966) 报道了同工酶的这个比率在 2.50 到 4.19 之间变化。这一点，连同缓冲液和 pH 值的影响，似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑。

许多不同的方法用于过氧化物酶活性的测定。下面列出了由艾美捷Worthington确定的一些近似转换。

• 1 个 Worthington 单位 = 4.6 个 Worthington 以前使用的邻联苯胺单位

• 1 个 Worthington 单位 = 0.62 个 ABTS 单位（每分钟氧化的微摩尔染料，pH 6.0，25°C，1.7 mM 染料）

• 1 个 Worthington 单位 = 2 个 ABST 单位（ µmole 每分钟氧化的染料，pH 5.0，25°C，8.7 mM 染料）

• 1 Worthington 单位 = 0.5 愈创木酚单位（每分钟氧化愈创木酚的 µmole，pH 7.0，25°C）

• 1 Worthington 单位 = 0.5 连苯三酚到 purpogallin单位（mg 产品每 20 秒，pH 6.0，20°C）

• 1 Worthington 单位 = 5 连苯三酚到 purpogallin 单位（在 pH 6.0，30°C 下每分钟微摩尔产品）

艾美捷Worthington过氧化物酶的测定：

方法：传统上，过氧化物酶活性以连苯三酚的氧化速率为单位表示，这是 Willstalter 和 Stoll 在 1917 年引入的一种方法，最近的研究表明这种方法有些不足。（Maehly 和 Chance 1954。）在过氧化物酶测定系统中已经使用了多种氢供体，包括可能致癌的化合物，例如邻联茴香胺。采用 4-氨基安替比林作为氢供体的改进测定法已被采用（Trinder 1966）。反应速率通过测量过氧化氢分解引起的 510 nm 处吸光度的增加来确定。在指定条件下，在 25°C 和 pH 7.0 条件下，一个单位会导致每分钟分解 1 微摩尔过氧化氢。

试剂：

0.2 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.0

0.0017 M 过氧化氢。用试剂级水将 1 ml 30% 过氧化氢（Merck Superoxol 或等效物）稀释至 100 ml。用 0.2 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.0 将 1 ml 该溶液进一步稀释至 50 ml。每天准备新鲜。

0.0025 M 4-氨基安替比林和 0.17 M 苯酚：通过将 810 mg 苯酚溶解在 40 ml 试剂级水中进行制备。加入 25 mg 4-氨基安替比林并用试剂级水稀释至终体积为 50 ml。

酶：

以 1 mg/ml 溶解在试剂级水中。临用前，进一步稀释以获得 0.02-0.04 ΔA/min 的速率。

程序：

将分光光度计调整到 510 nm 和 25°C。

将移液器移入每个比色皿，如下所示：

苯酚/氨基安替比林溶液 1.4 毫升

0.0017 M过氧化氢 1.5 毫升

在分光光度计中于 25°C 孵育 3-4 分钟以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。加入 0.1 ml 稀释酶并记录 A 510的增加4-5 分钟。从曲线的线性部分计算ΔA 510 /分钟。

计算：

 

注：虽然用苯酚安替比林法得到的反应速率比以前的方法低 4.5-4.7 倍，但过氧化物酶制剂是相同的。

RZ (Reinheitzahl) 是吸光度比，A 403 /A 275 (RZ) 已被用作纯度的指示。然而，香农等人。(1966) 报告说，同工酶的这个比率从 2.50 变化到 4.19。这一点，连同缓冲液和 pH 值的影响，似乎使这个比率作为纯度标准的准确性受到质疑。