蛋白质是组成生物细胞、组织的重要成分,生物的所有生命活动都离不开蛋白质的参与。蛋白质是生命的物质基础,是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者。生物材料中蛋白质含量的测定是生物学研究中最重要也是最基本的实验操作之一,目前常见的测定方法有考马斯亮蓝法(Bradford法)、紫外吸收法、双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lorry法)、二喹啉甲酸法(BCA法)和凯式定氮法(Kjedahl法)等。每种方法原理不同,操作不同,都有其优点和局限性。
本文介绍的是考马斯亮蓝法,即Bradford法测定蛋白质的相关内容,它是通过染色方法测定溶液中蛋白质浓度的方法,是目前迅速可靠且灵敏度最高的蛋白质测定方法之一。
实验原理:
Bradford蛋白质测定法是根据蛋白质与染料结合的原理设计的。考马斯亮蓝染料(G-250)在酸性溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合,使得染料的最大光吸收峰位置由原来的465nm变为595nm,溶液颜色也由原来的棕红色变为蓝色,反应迅速且稳定,形成的化合物颜色深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比关系,因此可通过测定结合染色后溶液在595nm处的光吸收度值来计算溶液中蛋白质的含量。
通过分光光度计先测定已知浓度的标准蛋白溶液染色后在波长595nm的吸光度A595并绘制标准曲线,然后测定同样染色后的待测蛋白溶液在波长595nm的吸光度值,根据标准曲线即可计算出待测蛋白质的浓度。
实验器材:
主要溶液/试剂:
实验操作:
点成DEN-600光度计, 是一款紧凑、便携、可电池供电的光度计,可以方便地放置在生物安全柜、培养箱中,该设备可容纳10mm光程的标准比色皿、普通圆底试管或离心管等。USB连接和DEN软件可进行数据传输、数据处理和计算。600 nm波长光学系统设计可以进行如下测量:估算细胞总数(OD600)、浊度测量(McFarland单位)、蛋白质浓度测量(Bradford 蛋白质测定法)。分光光度计通常应用于这些领域,因此DEN-600可作为分光光度计的平价替代品。