蛋白纯化-实验设计

小 M 不怕纯化“难”，IP、WB 只等闲。泡了两年实验室的小 M，理论与实操经验共有，且看我如何闯过蛋白纯化的几道“关”。

   

第一关 产品选择

 

小 M 敲黑板：此关最基础也最重要，谨防“一步错，步步错”。

亲和层析作为经典、高效的纯化方法，利用目的分子与填料配基之间特异且可逆的相互作用，可以从细胞裂解液或其他生物样品中，一步纯化得到较高纯度目的分子。选择一款合适的亲和纯化琼脂糖，可以高效、便捷、可靠地从生物样品中分离蛋白、抗体。如何选择才叫“合适”？且听我慢慢道来：

■ 抗体基础知识篇，“知己知彼百战百胜”

抗体 (Antibody)，又名免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)，是一种由 B 细胞产生的大型 Y 形糖蛋白。抗体以一个或多个 Y 形单体存在，每个 Y 形单体由 4 条多肽链组成：两条相同的重链 (Heavy Chain) 和两条相同的轻链 (Light Chain) (图 1)。

抗体重链 Fc 区域的特异性序列决定了 Ig 的类型，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。轻链则有两种类型，分别为 λ 型和 κ 型。

图 1. 抗体结构

■ 抗体——配体要相配！

心心念念纯化人源 IgG3，一通操作后，目的条带位置空空如也。最后发现，当初选择了 Protein A 当亲和配体。人源 IgG3 和 Protein A，不相配！λ 轻链和 Protein L，不相配！蛋白纯化也讲究门当户对。

抗体的亲和纯化配体包括 Protein A、Protein G、Protein L 等。对于多数哺乳动物，Protein G 比 Protein A 对 IgG 有更高的亲和力，如人 IgG3、小鼠 IgG1 和大鼠 IgG2a，但 Protein G 不能和人的 IgM、IgD、IgA 等结合。

与 Protein A、Protein G 相比，Protein L 具有更广谱的 Ig 结合能力，几乎可结合所有含有 kappa 轻链的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及单链可变片段 (scFv) 和 Fab 片段。谨记根据抗体类型，选择合适的亲和纯化配体 (图 2)。

图 2. 人源抗体与 Protein A、Protein G、Protein L 结合能力对照表

  

第二关 使用方法选择

  

MCE Protein A、Protein G、Protein L 琼脂糖，可从血清、细胞培养上清液或腹水中一步分离抗体；Anti-Flag 亲和凝胶 可通过 IP 等方法捕获目的蛋白；链霉亲和素琼脂糖 则可和生物素化样本高效结合。

抗体纯化“大”实验，IP、Pull Down“小”操作，重力柱“大”而离心管“小”焉。杀鸡焉能用宰牛刀，产品详细使用方法奉上 (如下方案仅供参考，详见各产品使用说明)。

■ 重力过柱法，适合从血清等生物样本中分离、纯化抗体。一次实验获得大量抗体，妙！

1）装填：根据样品量取适量的琼脂糖填料加入亲和层析柱，让储存液靠重力流出；

2）平衡：随后用平衡 Buffer 对柱子进行平衡；

3）上样、洗杂：将样品上到平衡好的柱子上后，继续用平衡 Buffer 进行杂质的清洗和去除。

4）洗脱：最后用洗脱 Buffer 将目的样品洗脱。

图 3. 重力过柱，纯化抗体

■ 离心法，适合通过 IP 捕获蛋白或研究蛋白-蛋白间相互作用。精细化操作，稳！

将 Anti-Flag 亲和凝胶吸入离心管，使用离心法操作。离心的方式同样经平衡 → 上样 → 洗杂 → 洗脱四个步骤，前三个步骤 Buffer 的置换通过离心弃掉上清来实现，最后洗脱时离心收集上清。

图 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用步骤

 

第三关 目的蛋白结合、洗脱

Input 明明有目的蛋白，目的蛋白明明已结合，但洗脱液中却没有目的条带。

巧设对照，巧留样，蛋白洗脱，我在行。

■ 巧妇难为无米之炊，想让我“无中生有”？No Way！

检测结果无条带，也许是以下原因。

PS：设置 Input 对照，确定目的蛋白已表达；保留上样后的流出液/离心后上清液，确定样本已结合。每步操作“留一手”，全面复盘 (分析实验失败原因) 有帮助。

■ “变性”？“非变性”？下游实验应用来决定

1）变性洗脱法 此方法洗脱的蛋白样品后续可直接做 SDS-PAGE 检测，简便、高效。

2）非变性洗脱法 此方法洗脱的蛋白样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。常用的有酸性洗脱法，低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。

■ 洗脱后杂带多、纯度低

面对这个棘手的问题，我们首先需要分析杂蛋白的来源：是来自于目的蛋白的降解产物？与填料的吸附？还是与目的蛋白的互作？

1）蛋白部分降解：使用恰当的蛋白酶抑制剂；如对于低 pH 环境很敏感，需在洗脱前的接收管中提前加入中和液。

2）蛋白非特异性结合在抗体、凝胶或离心管壁上，建议对裂解液进行预处理，去除非特异性蛋白；在最后一次洗涤前，将样品转移到新的离心管中操作；洗涤效果不佳，建议增加洗涤时间及次数，增加洗涤 Buffer 中 NaCl 或去垢剂的浓度等。

 

第四关 WB

 

这里来抄个作业，3、2、1，上链接我就不信这个邪！打破 Western Blot 玄学操作。

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