Worthington真菌分泌酶研究 丨半乳糖氧化酶方案

半乳糖氧化酶 (GAO) 是一种真菌分泌酶，可催化一系列伯醇氧化为相应的醛，同时将分子氧还原为过氧化氢。

 

Worthington 半乳糖氧化酶特异性：

GAO 具有广泛的底物特异性，但具有显着的立体特异性，仅氧化底物的 D-异构体 (McPherson et al . 1992)。GAO 将氧化游离和聚合形式的半乳糖和一些半乳糖衍生物。氧化发生在 C6 位置。

艾美捷Worthington 半乳糖氧化酶化学性质：

分子量：68.5 kDa（根据翻译的 DNA 序列和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳计算，McPherson et al. 1992）

68.0 ± 3.0 kDa（由物理测量确定，Cooper等人1959）

最佳pH值：7.0（库珀等人，1959 年）  

等电点：7.75（理论）

消光系数：

122,480 cm -1 M -1（理论值）

E 1%, 280 = 17.87 (理论)

抑制剂：

氰化物

二乙基二硫代氨基甲酸酯

叠丨氮化物

羟胺

乙二胺四乙酸

应用

血液和其他生物体液中半乳糖的定量测定（Frings 和 Pardue 1964、Hankin 1966 和 Roth等人1965）

组织化学定位半乳糖 (Roberts and Gupta 1965)

检测和区分糖蛋白 (Itaya et al . 1975)

艾美捷Worthington 半乳糖氧化酶测定：

Method : 在过氧化物酶/邻联甲苯胺偶联系统中测量反应速度，作为由半乳糖氧化引起的A 425的增加。在 25°C 和规定条件下的 pH 值 6.0 下，一个单位导致 A 425的变化为每分钟 1.0。

试剂：

0.1 M 磷酸钾缓冲液，pH 6.0

0.5% 邻甲苯胺。注意：据报道邻甲苯胺具有致癌性。小心轻放。

过氧化物酶。将 Worthington 过氧化物酶（代码：HPOD）以大约 60 u/ml 的浓度溶解在试剂级水中。

10% 半乳糖。静置过夜以达到突变平衡。

酶：

以 1 mg/ml 的浓度溶解在试剂级水中。进一步稀释至浓度为 0.2 - 0.5 单位/ml。

程序：

将分光光度计调整到 425 nm 和 25°C。

通过将 0.1 ml tolidine 添加到 12 ml 0.1 M 磷酸钾缓冲液 pH 6.0 中来制备 tolidine-缓冲混合物。

将移液器移入每个比色皿，如下所示：

联苯胺缓冲液 1.7 毫升

10% 半乳糖 1.5 毫升

过氧化物酶 0.1 毫升

在分光光度计中于 25°C 孵育 3-4 分钟以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。加入 0.1 ml 适当稀释的酶并记录 A 425 /min 的增加。从曲线的初始线性部分。