NK试剂盒使用注意事项及NK细胞培养攻略

NK细胞

自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，不表达T细胞和B细胞所特有的膜表面分子。无需抗原的预先刺激与活化即可直接杀伤被病毒感染的自身细胞或肿瘤细胞，与抗肿瘤、抗感染和免疫调节有关，是固有免疫最重要的组成成分之一。

NK细胞大概约占外周血淋巴细胞的10％—15％，主要源于骨髓中的造血干细胞，由NK前体细胞发育分化而来，是肿瘤免疫微环境中的重要效应细胞。人NK细胞可根据其表面标志物CD56的表达分为两类：CD56dim和CD56bright，其中CD56dimNK细胞主要存在于外周血中，可表达颗粒酶、穿孔素直接杀伤肿瘤细胞，CD56brightNK细胞主要存在于淋巴器官中，不表达穿孔素，产生大量的细胞因子，如γ干扰素，肿瘤坏死因子α，IL-12、IL-15和IL-18，具有重要的免疫调节功能。NK细胞是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）的主要效应细胞，对清除肿瘤细胞、控制细菌和病毒感染具有重要作用。

用于肿瘤免疫治疗的NK细胞策略有：体外活化的自体或异体NK细胞治疗；联合NK细胞和单抗药（如免疫检查点抑制剂）来诱导抗体特异的细胞毒性；构建CAR-NK细胞免疫疗法等，这种细胞疗法的治疗关键，在于产生数量足够的、能够识别并杀伤肿瘤的免疫细胞以及效应细胞。它们在到达肿瘤所在的部位后能够被激活，发挥抗肿瘤的作用；除此之外，还可以替代修补或者改善化疗所引起的免疫功能受损。

目前体外NK培养技术目前已经很成熟，针对于我司的NK细胞培养试剂盒，现归纳整理了试剂盒使用注意事项及攻略，方便老师们在NK培养时查阅。

首先在开始实验之前，我们要确认一下所需物料是否充足、设备是否都正常运行，如果均正常的话就可以进行接下来的试验了，在这里小编整理了一些关于NK细胞培养的攻略，主要涉及到物料的使用及操作方法等。

01

培养基的使用

① 每次补液前需要将培养基在室温下自然复温。

② 禁止将整瓶培养基放入37℃孵箱复温，否则会加速补液培养基中细胞因子的失活。

③ 配置好的扩增培养基（含IL-2）时效较短，超过一周不建议使用，尤其是活化前期（前7天）。

02

正确处理和保存血浆：具体见说明书。灭活离心后的血浆要确保澄清，添加血浆时需考虑抗凝剂对血浆的稀释作用。

03

培养袋的使用：培养体积小于1L的时候，需要折叠培养袋再进行放置。建议使用我司推荐型号。

04

灵活掌握补液时机：细胞扩增状态不理想时，前期补液可推迟补液时间，不要调整补液的体积尤其注意第一次补液的时机。装袋后的补液体积和补液时间可根据细胞状态进行调整。

05

控制细胞结团：细胞装袋前，需要根据克隆团的情况充分拍散细胞。装袋后也需每天对袋子进行拍打，揉搓肉眼观察较大的细胞团。

06

培养初期不要随意晃动培养瓶：否则活化的克隆团容易飘起来，而降低包被因子对细胞团的活化。

07

分离PBMC:推荐用进口淋巴细胞分离液

①最高的得率和细胞活性

②减少血小板和细胞碎片的残留（太多影响NK细胞贴壁，进而影响活化）

③种瓶密度：PBMC铺瓶的起始细胞密度建议2×106个/mL，脐血初始NK比例较低时，可适当提高初始铺瓶细胞密度至3-4×106个/mL。

08

细胞铺瓶（推荐用电动移液器打到非包被接触的瓶底）

①分离的PBMC用生理盐水洗涤2次重悬于25ml培养基（保证细胞分散）

②电动移液器打到非包被接触的瓶底，轻轻摆动瓶子铺匀即可，时间尽量短

09

设备保养：定期检查CO2培养箱温度、浓度并及时更换滤网。定期保养和清洁生物安全柜。

10

环境监测：定期更换初效、中效、高效过滤器，保证洁净区环境标准。

11

固定实验耗材种类和型号：需提前评估变更型号、规格对培养效果的影响，如175的培养瓶，细胞培养袋。

同立海源AMMS®NK细胞培养试剂盒套装组分均采用公司自产的GMP级细胞因子制备，并采用进口药用包材在GMP制药环境生产，适用于自体外周血或脐血细胞中分离得到的单个核细胞体外扩增培养。另外该试剂盒已通过美国FDA 的 DMF II类备案（035588），不仅满足客户对高纯度、高活率的NK细胞需求，并且满足CAR-NK细胞药物临床实验要求。

——NK、CAR-NK细胞药物临床实验最佳选择！

NK总细胞扩增变化

NK细胞扩增比例

PBMC培养流式结果

关于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立于2011年，专注细胞和基因治疗（CGT）上游GMP级原料试剂研发，致力于为生命科学提供可靠的产品与服务。产品涉及细胞分选磁珠试剂，真核/原核重组蛋白、无血清培养基、细胞培养试剂盒、转染试剂、基因编辑工具酶等。为细胞和基因治疗药物、抗体药物开发、细胞储存等生物制药和IVD领域提供核心原料试剂与服务。

北京同立海源生物科技有限公司的全资子公司北京景达医疗器械有限公司建有2000㎡的研发实验室及GMP级洁净车间，包括真核与原核蛋白表达工程平台、细胞培养技术开发平台、体外诊断试剂生产平台，通过ISO13485和ISO9001双认证，部分产品已获美国FDA DMF备案。